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血小板浓缩生长因子对正畸大鼠牙移动及牙周组织 CCR- 1 和 HO- 1 表达的影响

 2022-11-25 15:37:21  来源:123杂志网 

  摘要  目的:  研究血小板浓缩生长因子  (concentrated growth factors, CGF)  对正畸大鼠牙移动及牙周组织 CC 类趋化因子受体 - 1 (CC chemokine receptor- 1, CCR- 1)及血红素氧合酶 - 1(heme oxygenase- 1, HO- 1)表达的影响。方法:150 只大鼠随机分为对照组和 观察组,每组 75 只,两组均建立正畸牙移动模型,观察组每日腹腔注射 10 % CGF 生理盐水溶液,对照组注射等体积生理盐水溶 液,共注射 14 d。分别检测第 0 d、1 d、3 d、7 d 和 14 d 两组大鼠的牙移动距离,TRAP 染色并进行破骨细胞计数,检测牙周组织中 CCR1 和 HO- 1 mRNA 的相对表达 。结果:随正畸力作用时间的延长,两组大鼠牙移动距离均显著增长、破骨细胞计数显著增多、 牙周组织中 CCR1 和 HO- 1 mRNA 的相对表达均显著升高(P<0.05);对照组与观察组在第 1 d 和第 3 d 时牙移动距离相比无统 计学差异(P>0.05) ,而在第 7 d 开始,观察组牙移动距离显著长于对照组(P<0.05);观察组大鼠破骨细胞计数和牙周组织中 CCR1 和 HO- 1 mRNA 的相对表达均显著高于同时间点的对照组(P<0.05) 。结论:CGF 可促进正畸大鼠牙移动,增加破骨细胞数 量,从而促进正畸牙移动和牙周组织重建,其机制可能与增加牙周组织中 CCR1 和 HO- 1 的表达水平有关。

  

  前言

  

  正畸治疗是通过使用矫治器产生力及激活力,将力作用于牙齿、颌骨和颞下颌关节,导致牙周支持组织、颌骨周围骨缝或 关节发生相应改建,使牙齿或颌骨产生移动以达到口颌系统的 美观、稳定和平衡[1],正畸牙移动的实质和生物学基础为牙和牙周组织的改建,是一个涉及诸多因素调控的复杂过程[2] 。近年 来 ,  随着对细胞因子及其相关受体研究的不断深入,CCR 及 HO- 1 被认为在正畸牙移动中发挥关键调控作用 ,前者可通过 介导核因子 κB 受体活化因子配体(receptor activator for NF- κB ligand, RANKL)  而影响成骨细胞和破骨细胞的趋化和运输过 程[3,4];后者被认为与牙本质细胞的增殖和分化、血流调控等过 程密切相关[5,6]。CGF 是通过特定变速离心分离制备所得的自体 来源的生长因子浓缩制品,在血小板被激活后,可释放包括血 管内皮生长因子  (vascular endothelial growth factor, VEGF) 、血 小板源性生长因子  (platelet-derived growth factors, PDGF) 、胰 岛素样生长因子(insulin like growth factor, IGF) 、转化生长因子 - β1(transforming growth factor- β1, TGF- β1)以及碱性成纤维细 胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)等在内的多种 生物活性因子,具有促进成骨细胞增殖和分化、骨修复、组织再 生、伤口愈合和血管生成等作用,因此在骨科、皮肤科、整形科 等均具有广泛的临床应用[7,8],但在正畸牙移动及牙周组织修复 方面的研究鲜有报道 。因此,本研究通过建立正畸牙移动大鼠 模型 ,   旨在探究 CGF 对正畸大鼠牙移动效果及牙周组织中 CCR1 和 HO- 1 表达的影响,以期为 CGF 在口腔正畸方面的临 床应用提供一定的理论支持。

  

  1 材料与方法

  

  1.1  材料

  

  1.1.1  实验动物     选取 150 只健康雄性 SPF 级 Sprague-Daw- ley(SD)大鼠,体重 190-210 g,由甘肃省中医药大学 SPF 级实 验动物中心提供 ,常规饲养于 SPF 级恒温恒湿洁净屏障环境 中,给予磨碎的固体饲料喂养,正常昼夜交替,实验开始前适应 性饲养一周。

  

  1.1.2  主要试剂及仪器     4 %多聚甲醛 、抗酒石酸性磷酸酶 (Tartrate-resistant acid phosphatase staining, TRAP)  试剂盒:上 海碧云天生物技术有限公司;CCR1、HO- 1 抗体:美国 Sigma 公 司;BCA 蛋白测定试剂盒、Trizol 试剂 、逆转录试剂盒:Invitro- gen 公司;Medifuge 离心加速机:意大利 Silfradent 公司;电子天 平:瑞士 METTLERTOLEDO 公司;超低温冰箱:美国 Thermo Scientific 公司;石蜡组织切片机:德国 Leica 公司;光学显微 镜:尼康仪器有限公司;紫外分光光度仪:日本岛津公司;实时 荧光定量 PCR 仪:美国 Bio-Rad 公司;正畸结扎丝:杭州新齿 科材料有限公司;正畸镍钛螺旋拉簧:中国速航 NIC 公司;快 速牙科手机:中国天天齿科公司;正畸测力计:日本 TOMY 公 司;游标卡尺:广州仪表仪器有限公司。

  

  1.2  实验方法

  

  1.2. 1  CGF 的制备     取 8 周龄健康雄性 SD 大鼠心脏血液制 备 CGF。腹腔注射 10 %水合氯醛(0.4 mL/100 g)麻醉供体大 鼠,然后通过心脏穿刺将血液直接放入不含抗凝剂的无菌试管 中 ,并立即离心约 13 min ,  管内纤维蛋白血沉棕黄层即为 CGF,收集并将其移至 EP 管中,再按体积比配成 10%的 CGF 生理盐水溶液备用[9]。

  

  1.2.2  分组及模型建立     将 150 只大鼠随机分为对照组和观 察组,每组 75 只 。腹腔注射 1 %戊巴比妥钠麻醉大鼠,开口器 撑开口腔,使用快速涡轮机在左上第一磨牙近颈部颊舌面打磨 出约 0.50 mm 深浅沟,用 0.20 mm 正畸结扎丝穿过第一、二磨 牙间隙,连接镍钛螺旋弹簧,正畸测力计控制产生 50 g 的拉簧 拉力,在切牙冠颊舌面的远中面打磨 0.50 mm 槽沟,将结扎丝 固定于沟内,连接拉簧的另一端,光固化树脂封闭固定牙颈部 以防结扎丝松动滑脱,增强支抗,每日检查加力装置是否完整, 若有脱落及时修理 。观察组每日腹腔注射 10 % CGF 生理盐水 溶液,对照组注射等体积生理盐水溶液,共注射 14 d。

  

  1.2.3  牙移动距离测定     分别于第 0 d、1 d、3 d、7 d 和 14 d 时 自各组中随机选取 5 只大鼠,1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,制 作上颌精确牙列印模,灌注超硬石膏模型,用游标卡尺测定左 上第一、二磨牙近中颊沟点之间的距离,连续测量 3 次取平均 值,建模前后所测距离之差即为正畸牙移动距离。

  

  1.2.4  TRAP 染色破骨细胞计数     分别于第 0 d、1 d、3 d、7 d 和 14 d 时自各组中随机选取 5 只大鼠 ,处死后完整取出左上 颌第一磨牙及周围颌骨 ,置于 4 %多聚甲醛溶液中固定,48 h 后取出,于 10% EDTA 溶液中脱钙 4 周,期间隔日更换溶液, 以针尖可无阻力刺穿组织为脱钙完成标准 ,乙醇梯度脱水,腭 侧朝下石蜡包埋,按近远中方向切 4 um 厚切片,将石蜡切片行 TRAP 染色,显微镜下观察并计数,每张切片取 5 个视野,以平 均值作为该只大鼠的破骨细胞数。

  

  1.2.5  CCR1 和 HO- 1 mRNA 的相对表达量检测     分别于第0 d、1 d、3 d、7 d 和 14 d 时自各组中随机选取 5 只大鼠处死,迅 速拔除第一磨牙,取所需牙周膜和牙槽骨,称重,置于 1.5 mL Rnase-free 溶液中,加入 1 mL Trizol 试剂,研磨、匀浆,提取总 RNA,于 260 nm 和 280 nm 波长下测定吸光度值。将总 RNA逆 转录为 cDNA 进行 PCR 反应,以β-actin 作为内参,采用 2- △△Ct 法计算各组中 CCR1 和 HO- 1 mRNA 的相对表达量,引物序列 见表 1 ,反应条件如下:95 C预变性 2 min;90 C 10 s、65 C25 s、65 C退火延伸 30 s,共 40 个循环。

  

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  1.3  统计学方法

  

  应用 SPSS22.0 软件进行数据统计分析 ,计量资料以均数±标准差(x±s)表示,比较采用 t 检验,以 P<0.05 表示差异有统计学意义。

  

  2  结果

  

  2.1  两组大鼠牙移动距离比较

  

  随正畸作用时间的延长,两组大鼠牙移动距离均显著增长(P<0.05);对照组与观察组在第 1 d 和第 3 d 时牙移动距离相 比无统计学差异(P>0.05),而在第 7 d 开始,观察组牙移动距 离显著长于对照组(P<0.05),见表 2。

  

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  2.2  TRAP 染色破骨细胞计数

  

  第 0 d 时两组大鼠破骨细胞计数无统计学差异(P>0.05) ; 随正畸时间延长,两组大鼠破骨细胞计数均显著增多(P<0.05),自第 7 d 开始趋于平稳;观察组大鼠自第 1 d 开始破骨细胞计 数均显著高于同时间点的对照组(P<0.05),见表 3。

  

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  2.3  CCR1 和 HO- 1 mRNA 的相对表达比较

  

  第 0 d 时两组大鼠牙周组织中 CCR1 和 HO- 1 mRNA 的相 对表达无统计学差异(P>0.05);随正畸时间延长,两组大鼠牙 周组织中 CCR1 和 HO- 1 mRNA 的相对表达均显著升高  (P<0.05),直至第 7 d 时趋于平稳;自第 1 d 开始,观察组大鼠牙周 组织中CCR1 和 HO- 1 mRNA 的相对表达均显著高于同时间点 的对照组(P<0.05),见表 4。

  

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  3 讨论

  

  正畸治疗过程是通过对牙齿等部位施以持续性的作用力,纠正牙齿畸形或错颌畸形的矫正方法,其中涉及复杂的口腔骨 组织损伤的修复[10,11] 。在正畸力的作用下,牙周膜受压变薄变 窄,牙周膜中未分化的间充质细胞不断增殖和分化,牙周组织不断再生,破骨细胞活跃,骨吸收增强,牙槽骨和牙周膜组织发 生改建[12,13]。CGF 为当前最新一代自体血小板浓缩物,其存在天 然的三维纤维蛋白支架,并包含多种内源性生长因子,当血小 板被激活后,可释放纤维蛋白、纤维连接蛋白、ADP、ATP、肾上 腺素、第 V 因子、IGF、胺及钙离子等,可有效促进局部细胞的 增殖分化,改善创面愈合、软组织再生和骨组织的修复,因而广 泛应用于骨科、皮肤科、整形科等[14-16] 。多项研究[17,18]证实,CGF 对单核巨噬细胞、间充质干细胞、嗜中性粒细胞以及成纤维细 胞等均具有募集作用 ,可促进肌细胞和成纤维细胞的增殖,参 与伤口愈合中的血管新生 、纤维组织的形成和再上皮化等过 程 。CGF 可促进成骨细胞和破骨细胞的增殖、提高细胞分化速 度、促进其生长,此外其中的纤维蛋白等组织还可为骨细胞的 生长提供支架,同时还可促进骨膜细胞的增殖和迁移能力,从 而促进骨修复重建[19]。

  

  既往研究大部分着重于 CGF 促进骨组织和软组织的修复 重建 ,而对正畸治疗过程中牙移动和牙周组织改建的研究较 少 。ZHANG 等的体外研究[20]发现,CGF 可促进牙周膜成纤维 细胞的增殖和成骨细胞的分化 。AGHAMOHAMADI 等[21] 同样 报道称,CGF 联合牙周膜干细胞诱导培养基可促进人牙周膜干 细胞的增殖和分化,从而促进牙周组织的再生 。本研究结果显 示,随正畸力作用时间的延长,两组大鼠牙移动距离均显著增 长,在第 7 d 开始,观察组牙移动距离显著长于对照组;破骨细 胞计数结果亦显示,观察组大鼠破骨细胞计数均显著高于相同 时间点时的对照组,上述结果均提示 CGF 可能促进了正畸牙 移动和牙周组织的重建过程,与 ZHANG 等[20] 和 AGHAMO- HAMADI 等[21]研究结果一致。

  

  牙周改建的过程受诸多因素的影响,随着分子生物学的不 断发展,相关细胞因子与正畸牙移动之间的联系越来越受学者 们的关注。趋化因子是细胞因子超家族中的一类可使细胞发生 趋化运动的小分子蛋白多肽,可趋化白细胞、淋巴细胞等免疫 细胞到达免疫应答部位,从而参与机体免疫调节和免疫病理反 应[22] 。CCR1 为 CCR 对应的主要受体之一,既往研究[23,24]认为, CCR1 可通过控制前体成骨细胞和破骨细胞的分裂、分化和活 化等过程,而在 RANKL 介导的成骨细胞、破骨细胞、原始骨髓 细胞中均有表达,对成骨细胞和破骨细胞的趋化及运输过程发 挥关键的调控作用,从而参与牙周组织的改建过程 。Rd A 等[25]  在 CC 类趋化因子配体 3(CC chemokine ligand 3, CCL3)缺陷 小鼠和 CCRl 缺陷小鼠体内的研究发现,相同正畸力作用下的 基因缺陷小鼠牙周组织中肿瘤坏死因子 -α (tumor necrosis fac- tor-α, TNF-α) 、RANK、RANKL 的表达水平以及骨改建明显少 于正常小鼠 。Rath-Deschner B 等研究[26]发现,快速扩弓 7 d 后, 人体牙周组织中 CC 类趋化因子及多种炎性细胞因子的表达 水平均显著升高。而在本研究中,随正畸力作用时间延长,两组 大鼠牙周组织中CCR1 mRNA 的相对表达均显著升高,直至第 7 d 时到达峰值;此外,观察组大鼠牙周组织中 CCR1 mRNA 的 相对表达显著高于相同时间点的对照组大鼠,提示 CCR1 可能 参与了正畸牙移动和牙周改建的过程 ,与上述 Rath-Deschner B 等研究[26]结果一致。

  

  HO- 1 参与了机体多种生理病理过程,尤其是在感染、休克 等应激状态下作用明显,并可与其他因子如过氧化氢酶、谷氨酸半胱氨酸连接酶催化亚基、醌氧化还原酶 1 等相结合形成内 源性保护系统,对抗内源性和外源性应激反应[27,28]。相关研究显 示:HO- 1 参与了牙髓炎的发生发展,HO- 1 可通过激活 Sonic Hedgehog 信号通路而改善趋化因子 CX3CL1 和前列环素 I2 (PGI2)的水平,起到抗炎、抗氧化作用;此外,HO- 1 可增加与牙 本质分化细胞相关的信使 RNA 的表达 ,提高细胞的增殖能力 和矿化物水平,从而调节牙髓细胞的增殖和分化[29,30]。在本研究 中,随正畸力作用时间延长,两组大鼠牙周组织中 HO- 1 mRNA 的相对表达均显著升高,直至第 7 d 时到达峰值;此外,观察组 大鼠牙周组织中 HO- 1 mRNA 的相对表达显著高于相同时间 点的对照组大鼠,表明 HO- 1 可能参与了正畸牙移动和牙周改 建的过程,与上述研究结果内容相符[29,30]。

  

  综上所述,本研究表明,CGF 可促进正畸大鼠牙移动,增加 破骨细胞数量 ,提高牙周组织中 CCR1 和 HO- 1 的表达水平, 促进了正畸牙移动和牙周组织重建,但其具体作用机制以及正 畸临床长期应用的安全性和有效性,仍待进一步深入研究。

  

  冯玉霞 1      郭   艳 1      汉媛媛 2       张   婧 1      李健学 1


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